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Jun 05, 2023

Die Alterung von C. elegans wird von selbst beschleunigt

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4381 (2023) Diesen Artikel zitieren 3815 Zugriffe auf 97 altmetrische Metrikdetails Bei postreproduktivem C. elegans, zerstörerische Umnutzung somatischer Biomasse

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4381 (2023) Diesen Artikel zitieren

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97 Altmetrisch

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Bei postreproduktiven C. elegans unterstützt die zerstörerische Umnutzung somatischer Biomasse die Produktion von Eigelb, das, wie kürzlich gezeigt wurde, entlüftet wird und als Nahrung für Larvennachkommen dienen kann. Dies erinnert an den selbstmörderischen Fortpflanzungsversuch (Fortpflanzungstod), der für semelpare Organismen wie den Pazifischen Lachs typisch ist. Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass C. elegans einen reproduktiven Tod aufweist, haben wir Geschwisterpaare der Gattungen Caenorhabditis und Pristionchus mit Hermaphroditen und Weibchen verglichen. Wir berichten, dass eine Dotterentlüftung und eine konstitutive, frühe Pathologie mit großen anatomischen Veränderungen nur bei Hermaphroditen auftreten, die auch eine kürzere Lebensdauer haben. Darüber hinaus unterdrückt die Keimbahnentfernung nur bei Hermaphroditen die Seneszenzpathologie und verlängert die Lebensdauer deutlich. Dies steht im Einklang mit der Hypothese, dass C. elegans einen reproduktiven Tod aufweist, der durch Keimbahnablation unterdrückt wird. Wenn dies zutrifft, würde dies einen großen Unterschied im Alterungsprozess zwischen C. elegans und den meisten höheren Organismen bedeuten und möglicherweise die außergewöhnliche Plastizität beim Altern von C. elegans erklären.

Die Alterungsmechanismen unterscheiden sich wahrscheinlich zwischen Organismen mit semelparer und iteroparer Lebensgeschichte. Semelpare Arten weisen nur eine einzige Fortpflanzungsepisode auf, die oft einen so intensiven Fortpflanzungsaufwand erfordert, dass sie zu einem schnellen Tod (Reproduktionstod) führt1,2. Organismen, die einen semelparen Fortpflanzungstod aufweisen, reichen von einkarpischen Pflanzen bis hin zu pazifischen Lachsen. Im Gegensatz dazu sind iteropare Arten, zu denen die meisten Säugetiere gehören, zu mehreren Fortpflanzungsrunden fähig und durchlaufen einen langsameren Alterungsprozess.

Um die Bedeutung des Begriffs Semelparität genau zu beschreiben: Obwohl einige, aber nicht alle Organismen mit einer einzigen Fortpflanzungsepisode einen Fortpflanzungstod aufweisen, wird der Begriff Semelparität oft verwendet, um speziell semelpare Organismen zu bezeichnen, die einen Fortpflanzungstod zeigen. Gleichzeitig ist das Auftreten eines reproduktiven Todes bei Organismen mit nur einer einzigen reproduktiven Episode ausschlaggebend für Semelparität im zweiten Sinne des Begriffs.

Seit Ende der 1970er Jahre wird der Fadenwurm Caenorhabditis elegans intensiv als Modellorganismus genutzt, um die Ursachen des Alterns zu verstehen. Dies führte zur Entdeckung einer bemerkenswert hohen Plastizität im Alter dieser Art3,4,5, wobei eine bis zu zehnfache Verlängerung der Lebensdauer beobachtet wurde6. C. elegans zeichnet sich auch durch die Schwere und das besonders frühe Auftreten seneszierender Pathologien aus, die insbesondere Organe betreffen, die an der Fortpflanzung beteiligt sind7,8,9,10,11,12. Bei postreproduktiven Hermaphroditen von C. elegans wird Darmbiomasse in Eigelb umgewandelt, was zu Darmatrophie und Eigelbansammlung führt9,13. Wir haben kürzlich gezeigt, dass postreproduktive Mütter Eigelb ablassen, das als Milch (oder „Eigelbmilch“) fungieren kann, die von Larvennachkommen verzehrt wird, die Wachstum und Fortpflanzung unterstützen14.

Diese Art selbstzerstörerischer Fortpflanzungsbemühungen, bei denen die Umnutzung von Biomasse die Organdegeneration fördert, kommt häufig bei semelparen Organismen vor, die einen reproduktiven Tod erleiden. Die Entfernung der Keimbahn verlängert die Lebensdauer sowohl von C. elegans als auch von pazifischem Lachs erheblich, im letzteren Fall durch Unterdrückung des Fortpflanzungstodes5,15. Zusammen mit der einzelnen Fortpflanzungsepisode lassen diese Beobachtungen die Möglichkeit aufkommen, dass die ausgeprägte Plastizität in der Lebensdauer von C. elegans eine Funktion der Unterdrückung des Fortpflanzungstodes ist, dh dass diese Art semelpar ist.

Eine weitere hypothetische Möglichkeit besteht darin, dass sich bei C. elegans der reproduktive Tod als Folge des Hermaphroditismus entwickelt hat. Nematodenarten der Gattung Caenorhabditis sind entweder gonochorisch, mit etwa gleicher Anzahl an Weibchen und Männchen, oder androdioözisch, mit selbstbefruchtenden Hermaphroditen und seltenen Männchen16. Protandrischer Hermaphroditismus (bei dem zuerst Spermien und dann Eizellen produziert werden) ermöglicht es C. elegans, schnell neue Nahrungsgebiete zu besiedeln, allerdings auf Kosten einer kürzeren Fortpflanzungsdauer aufgrund der Erschöpfung der Eigenspermien16,17. Die Fähigkeit, somatische Biomasse in Eigelb umzuwandeln, um sie an die Nachkommen zu verfüttern, könnte es postreproduktiven C. elegans ermöglichen, diese Kosten zu senken und eine inklusive Fitness zu fördern14. Wenn dies zutrifft, sagt dies voraus, dass der reproduktive Tod bei Caenorhabditis-Hermaphroditen eintreten wird, nicht aber bei Weibchen, wo die obligatorische Fortpflanzung durch Paarung mit Männchen längere Fortpflanzungsspannen unterstützt.

In dieser Studie verwenden wir einen artübergreifenden Vergleichsansatz, um die Möglichkeit zu untersuchen, dass bei C. elegans der reproduktive Tod auftritt und durch Keimbahnablation unterdrückt wird. Dass C. elegans semelpar sein könnte, wirft interessante Fragen über die Relevanz der bei dieser Art identifizierten Alterungsmechanismen für diejenigen auf, die bei iteroparen Arten (wie dem Menschen) wirksam sind.

Das Auftreten selbstzerstörerischer Biomasseumnutzung zur Unterstützung der Dotterproduktion zur Entlüftung bei postreproduktiven Hermaphroditen von C. elegans erinnert an Mechanismen, die bei Organismen mit reproduktivem Tod wirksam sind2. Wenn sie zutrifft, sagt die Hypothese, dass sich der reproduktive Tod nach dem Auftreten der Protandrie beim Vorfahren von C. elegans entwickelte, voraus, dass es bei den Caenorhabditis-Arten zu einer Dotterentlüftung bei androdioözischen, aber nicht bei gonochorischen Arten kommen wird. Um dies zu testen, verglichen wir drei Paare von Geschwisterarten dieser Gattung, von denen eines androdioözisch (A) und das andere gonochoristisch (G) ist: C. elegans (A) vs. C. inopinata (G), C. briggsae (A) gegen C. nigoni (G) bzw. C. Tropicalis (A) gegen C. wallacei (G) (Abb. 1a). Diese Paare repräsentieren drei unabhängige Ereignisse in der Entwicklung des Hermaphroditismus ausgehend von gonochorischen Vorfahren18. Bei jedem Paar wurde bei Hermaphroditen, jedoch nicht bei Frauen, sowohl die Entlüftung des Eigelbs als auch die reichliche Ablage unbefruchteter Eizellen (die als Vektoren für das Eigelb dienen14) beobachtet (Abb. 1b, c; ergänzende Abb. 1a, b). Wie bei C. elegans hielt die Akkumulation von Vitellogenin (Dotterprotein) auch im späteren Leben in hohen Mengen bei Hermaphroditen von C. briggsae und C. Tropicalis an, nicht jedoch bei Weibchen von C. inopinata, C. nigoni und C. wallacei (Abb. 1d). Wir verglichen auch ein androdiözisch-gonochoristisches Geschwisterartenpaar aus der frei lebenden Nematodengattung Pristionchus und wiederum nur das früher entlüftete Eigelb und die Eizellen und sammelten im späteren Leben intern Vitellogenin an (Abb. 1b – d; ergänzende Abb. 1a – d). ). Pristionchus fehlte nachweislich die größere Vitellogenin-Art, die YP170 bei Caenorhabditis entspricht; Stattdessen wurde eine Anhäufung nur der kleineren Arten beobachtet, die Caenorhabditis YP115/YP88 entsprachen (ergänzende Abbildungen 1c, d).

ein phylogenetischer Baum, der androdioözische und gonochoristische Caenorhabditis-Geschwisterarten zeigt76. Schätzung der Zeit seit der Entstehung der Selbstsucht bei Hermaphroditen: C. elegans, 0,35–7,2 MYA; C. briggsae, 0,2–3,5 MYA (Lit. 77); C. Tropicalis, noch unbekannt. b Eigelbentlüftung ist bei Hermaphroditen vorhanden, jedoch nicht bei Frauen (n = 100 pro Versuch). Oben: Haupt-YP auf dem Höhepunkt der Entlüftung. Unten: Quantitative Daten normalisiert auf Gesamtdotter auf d4-6 in C. elegans. M = Markierung. Für vollständiges Gel siehe Quelldaten. c Unbefruchtete Eizellen werden von Hermaphroditen, aber nicht von Weibchen gelegt (3 Versuche; n = 10 pro Versuch). d Höhere interne Spiegel von Major YP bei Caenorhabditis-Hermaphroditen und P. pacificus-Hermaphroditen. YP-Banden wurden auf Myosin normalisiert, um Artenunterschiede in der Körpergröße auszugleichen. Einweg-ANCOVA (n = 10). Für alle internen YPs und Gelbilder siehe ergänzende Abbildung 1c, d. b, d Proteingelelektrophoresedaten mit kolloidaler Coomassie-Blau-Färbung. be Tiere sind unverpaart. b,c,d Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Versuchen, wobei jeder Punkt einen Versuch darstellt. b, c Einfaktorielle ANOVA (Bonferroni-Korrektur) oder zweiseitiger ungepaarter t-Test. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001, **** p < 0,00001 (p-Wert von links nach rechts = b: 0,0014, 0,0145, 0,0012, 0,0070; c: 0,0010, 0,0033, 0,0080 , 0,0087; d: 0,0000, 0,0133, 0,0133, 0,0000).

Die Hypothese, dass die Dotterentlüftung auf Semelparität hinweist, zusammen mit dem Vorhandensein einer Dotterentlüftung bei Hermaphroditen, aber nicht bei Weibchen, sagt voraus, dass nur erstere einen reproduktiven Tod erleiden, dh dass Weibchen länger leben und im Vergleich zu Hermaphroditen eine stark reduzierte Pathologie aufweisen. In Übereinstimmung damit war die Lebensdauer von C. Tropicalis (A)/C. bei Weibchen länger als bei Hermaphroditen. wallacei (G) und C. briggsae (A)/C. nigoni (G)-Paare, aber wie bereits berichtet19 war dies bei C. elegans (A)/C nicht der Fall. inopinata (G)-Paar (Ergänzende Abb. 2a, b).

Um mögliche Artenunterschiede in der Anfälligkeit für Infektionen durch die Nahrungsquelle E. coli auszuschließen20, wurde die Lebensdauer in Gegenwart eines Antibiotikums (Carbenicillin) gemessen, und hier lebten die Weibchen in allen drei Geschwisterartenpaaren länger (Abb. 2a, b; Ergänzung). Abb. 2a, b); Dieses Ergebnis legt nahe, dass C. inopinata überempfindlich gegenüber bakteriellen Infektionen ist, was möglicherweise auf ihre besondere natürliche Umgebung (Syconia von Feigenbäumen) zurückzuführen ist. Die optimale Kulturtemperatur für C. inopinata ist höher (25–29 °C) als die für C. elegans (20–22 °C)21, was die Möglichkeit erhöht, dass die Kultur von C. inopinata bei der suboptimal niedrigen Temperatur von 20 °C stattfindet °C könnte zu einer unverhältnismäßig niedrigen Lebensrate führen und dadurch die Lebensdauer im Vergleich zu C. elegans verlängern; C. inopinata lebte jedoch auch bei 25 ° C länger als C. elegans (Abb. Ergänzung 2c), was gegen diese Möglichkeit spricht. In ähnlicher Weise lebten die Hermaphroditen im Pristionchus-Geschwisterartenpaar kürzer (Abb. 2a, ergänzende Abb. 2a, b), was mit einem früheren Bericht über eine längere Lebenserwartung bei Pristionchus-Weibchen übereinstimmt .

a Weibchen leben länger als hermaphroditische Geschwisterarten (unverpaart, mit Antibiotika). Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Versuchen. Log-Rank-Test (Mantel-Cox). b Weibliche C. inopinata leben länger als C. elegans, wenn eine bakterielle Infektion durch ein Antibiotikum (Carbenicillin) (diese Abbildung; kombinierte Daten aus 3 Versuchen; n = 100 pro Versuch) oder UV-Bestrahlung von E. coli (ergänzende Abbildung) verhindert wird . 2d). a, b Statistische Details finden Sie in der Ergänzungstabelle 1 und die Daten zur Rohlebensdauer finden Sie in der Quelldatendatei. c Darmatrophie ist bei Hermaphroditen konstitutiv und bei Weibchen paarungsbedingt. Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Versuchen (n = 10 pro Versuch und Zeitpunkt). Einweg-ANCOVA mit auf d1 normiertem Score zur Bestimmung der prozentualen Veränderung der Darmmasse. Die Studienbedingungen waren nicht für alle Pathologien statistisch signifikant und daher wurde die Studie nicht weiter als Variable betrachtet. Einzelheiten zu statistischen Tests finden Sie im Abschnitt „Methoden“. Zur Messung von Pathologien, statistischen Vergleichen zwischen Arten und Behandlungen sowie repräsentativen Bildern von Pathologien, die zur Bewertung verwendet werden, siehe ergänzende Abbildung 4. d Pathologien, die mit reproduktivem Tod in Zusammenhang stehen, sind bei Hermaphroditen konstitutiv und werden bei Weibchen durch Paarung induziert. Die Wärmekarte vergleicht Unterschiede im Pathologieverlauf zwischen Arten und Behandlungen, indem berechnete Gradienten aus Pathologiemessungen über die Zeit in Z-Scores umgewandelt werden (siehe ergänzende Abb. 4a, d; 3 Versuche, wobei n = 10 pro Zeitpunkt pro Versuch, mit 5 Mal). zeigt bis d14, wenn die Pathologie für C. elegans ihren Höhepunkt erreicht. Dies ermöglicht einen Vergleich zwischen verschiedenen Pathologien, indem das Ausmaß einer bestimmten Pathologie auf das durchschnittliche Ausmaß dieser Pathologie in der Gruppe normalisiert wird (dargestellt durch einen Z-Score von 0, wobei ein Z-Score von +2 den maximalen Schweregrad der Pathologie in der Gruppe darstellt). −2 die gesündesten Tiere). Hierarchisches Clustering basiert auf paarweisen euklidischen Abständen. e Darmatrophie (blau) und Dotteransammlung (gelb) bei alternden C. elegans, aber nicht bei C. inopinata (d14, unverpaart). Repräsentative Nomarski-Bilder. Maßstab 25 µm. f Schwere Degeneration der intestinalen Ultrastruktur bei alternden C. elegans, aber nicht bei C. inopinata (Tag 14, unverpaart). Beachten Sie den Verlust von Organellen und Grundsubstanz. Repräsentative TEM-Schnittbilder durch den Darm. mv, Mikrovilli; au, autophagosomenartige Struktur, L, Lipidtröpfchen; G, Eigelb oder Darmkörnchen (vorläufige Identifizierung). Maßstab 1 µm (20.000x). g Zusammenhang zwischen Schweregrad der Pathologie und Lebensdauer. Lineare Regression des Medians aller Pathologie-Z-Scores (vgl. Abb. 2d) mit der Lebensdauer. Die Y-Achse zeigt die mittlere Lebensdauer jeder Art (mit Antibiotika behandelt). Es wird eine Linie der besten Anpassung gezogen, um die Punkte für die Caenorhabditis-Arten zu verbinden; Auf dieser Grundlage wird eine hypothetische Linie für die Pristionchus-Art gezogen. Informationen zur Regression einzelner Pathologien im Vergleich zur Lebensdauer finden Sie in der ergänzenden Abbildung 2e. **** p < 0,00001.

Als nächstes verglichen wir Muster der Seneszenzpathologie in den drei Geschwisterpaaren der Caenorhabditis-Arten mithilfe der Nomarski-Mikroskopie und der Transmissionselektronenmikroskopie. Zu den frühen, schweren Seneszenzpathologien bei erwachsenen Hermaphroditen von C. elegans gehören prominente Uterustumoren, Gonadenatrophie und -fragmentierung, Rachenverschlechterung sowie Darmatrophie in Verbindung mit der Ansammlung von Dotter7,8,9,23,24,25. Seneszierende Pathologien, die bei C. elegans beobachtet wurden, wurden auch bei den anderen beiden hermaphroditischen Arten von Caenorhabditis beobachtet, waren jedoch bei den Weibchen weitgehend nicht vorhanden, und dies traf auch auf das Pristionchus-Geschwisterartenpaar zu (Abb. 2c–e). Bei älteren Caenorhabditis-Hermaphroditen wurde eine auffällige Degeneration der Darm-Ultrastruktur beobachtet, was mit früheren Beobachtungen von C. elegans7,26 und C. briggsae27, einschließlich prominenter Autophagosomen, übereinstimmt (Abb. 2f; ergänzende Abb. 3). Solche Veränderungen wurden bei Frauen nicht beobachtet. Daher leben die Weibchen länger und weisen keine größeren anatomischen Veränderungen auf, die für seneszente Hermaphroditen charakteristisch sind.

Der Schweregrad der frühen Seneszenzpathologie bei Hermaphroditen variierte zwischen den Arten mit der Rangfolge C. elegans > C. Tropicalis > C. briggsae (Abb. 2c, d), und die Langlebigkeit der Hermaphroditen zeigte die umgekehrte Rangfolge (Ergänzungstabelle 1). Die abgestufte Variation des Pathologieniveaus mit der Lebensspanne steht im Einklang mit der möglichen Existenz eines Kontinuums zwischen dem Vorliegen und Fehlen eines reproduktiven Todes (dh zwischen Semelparität und Iteroparität; siehe unten) (Abb. 2g). Dies könnte bedeuten, dass C. elegans und C. briggsae späte bzw. frühe Stadien in der Entwicklung des konstitutiven reproduktiven Todes darstellen. Bemerkenswert ist, dass die geschätzte Zeit seit dem Beginn der Selbstbildung bei Hermaphroditen bei C. elegans (0,35–7,2 MYA) länger zurückliegt als bei C. briggsae (0,2–3,5 MYA). Darüber hinaus ist C. briggsae/C. Durch die Paarung von Nigoni-Arten können Nachkommen entstehen28, was mit der relativ neuen Divergenz dieser beiden Arten von einem gemeinsamen Vorfahren übereinstimmt.

Die obigen Vergleiche wurden mit unverpaarten Tieren durchgeführt, was bedeutet, dass Hermaphroditen Nachkommen hervorbrachten, Weibchen jedoch nicht. Somit könnten die beobachteten Unterschiede im Prinzip das Vorhandensein/Fehlen der Nachkommenproduktion widerspiegeln, obwohl zu beachten ist, dass die Verhinderung der eigenen Nachkommenproduktion per se keinen Einfluss auf die Lebensdauer von C. elegans hat3,4,29. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, verglichen wir die Lebensdauer und die Seneszenzpathologie bei verpaarten Tieren der verschiedenen Arten. Die Paarung (einschließlich der Exposition gegenüber männlichen Pheromonen sowie der Kopulation) verkürzte die Lebensdauer der meisten Arten, wie bereits bei C. elegans , und machte die längere Lebenserwartung der Weibchen zunichte (Abb. 3a; ergänzende Abb. 5a, b). Die Paarung führte auch bei Weibchen zu einer Darmatrophie und verstärkte sie bei Hermaphroditen, und verpaarte Tiere aller sechs Arten zeigten ein ähnliches Ausmaß an Darmatrophie (Abb. 2c, 3b, c). Ein vergleichbarer Effekt der Paarung wurde auch bei einer Reihe anderer Pathologien beobachtet, bei denen ein ähnlicher Grad der Verschlechterung bei begatteten Weibchen und Hermaphroditen beobachtet wurde, wie eine Clusteranalyse der quantifizierten Schwere der Pathologie zeigt, und Pristionchus-Arten zeigten den gleichen Trend (Abb. 2d). .

a Die Paarung bei Weibchen verkürzt die Lebensdauer erheblich, wie bereits für C. elegans gezeigt30,31,41. Mittelwert ± SD von 2 Versuchen. Log-Rang zwischen verpaarten und unverpaarten Tieren. Statistische Details finden Sie in der Ergänzungstabelle 2 und Rohdaten zur Lebensdauer finden Sie in der Quelldatendatei. b Repräsentativer TEM-Querschnitt, der eine Verringerung der Darmgröße bei C. inopinata bei der Paarung zeigt. Maßstab 5 μm (5.000x). c Repräsentative TEM-Bilder mit hoher Vergrößerung, die degenerative ultrastrukturelle Veränderungen im Darm von C. inopinata bei der Paarung zeigen, wobei ein Verlust der Bodenstruktur ähnlich wie bei unverpaarten C. elegans und im Gegensatz zu unverpaarten C. inopinata beobachtet wurde (vgl. Abb. 2f). Maßstab 1 μm (20.000x). d In den meisten Fällen hat Selbstsperma keinen Einfluss auf die Seneszenzpathologie bei Caenorhabditis-Hermaphroditen. Die Hauptausnahme sind Uterustumoren, die aufgrund des früheren Auftretens unbefruchteter Eizellen in der Gebärmutter früher auftreten, sich dann aber langsamer entwickeln, wie zuvor für C. elegans24 beschrieben. Auch bei C. Tropicalis wird ein leichter Anstieg der Darmatrophie beobachtet. Die Versuche wurden bei 25 °C durchgeführt, da RNAi bei dieser Temperatur Sterilität bei C. Tropicalis hervorrief. Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Versuchen (n = 5–10 pro Zeitpunkt in jedem Versuch). Kumulatives Link-Modell mit Gamma-Link-Funktion für Rachendegeneration, Gonadendegeneration und Uterustumoren, die als Ordnungszahlen bewertet werden. Einseitige ANCOVA mit auf d1 normalisiertem Score zur Bestimmung der prozentualen Veränderung der Darmmasse und einseitige ANCOVA ohne Normalisierung für Dotterpools. Die Studienbedingungen waren nicht für alle Pathologien statistisch signifikant und daher wurde die Studie nicht weiter als Variable betrachtet. Einzelheiten zu statistischen Tests finden Sie im Abschnitt „Methoden“. e Das Vorhandensein von Selbstsperma verkürzt die Lebensspanne in manchen Fällen geringfügig. Die Versuche wurden bei 25 °C (siehe d) und unter Einbeziehung von Carbenicillin durchgeführt, um mögliche störende Auswirkungen von Artenunterschieden in der Anfälligkeit für bakterielle Infektionen zu vermeiden. In früheren Studien zu C. elegans fog-2(q71) wurde festgestellt, dass Weibchen in einem Fall langlebig waren (25 °C, lebende E. coli)19 und in einem anderen Fall kurzlebig waren (20 °C, lebende E. coli)20 ; Der Grund für die Diskrepanz ist unklar. Kombinierte Daten von 3 Versuchen. Statistischer Test (Log-Rank), Vergleich mit Wildtyp-Weibchen: blaue Sterne; Vergleich mit Wildtyp-Hermaphroditen: rote Sterne. Überlebenskurven für alle Versuche finden Sie in der ergänzenden Abbildung 5c, statistische Details finden Sie in der ergänzenden Tabelle 3 und Rohdaten zur Lebensdauer finden Sie in der Quelldatendatei. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001, **** p < 0,00001.

Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass der reproduktive Tod durch die Paarung bei Weibchen ausgelöst wird. Dies würde eine mögliche Erklärung dafür liefern, wie sich solche ähnlichen Pathogenesemuster unabhängig voneinander bei den drei androdioözischen Arten entwickelten: als Folge eines Wechsels vom paarungsbedingten Fortpflanzungstod bei Weibchen zum konstitutiven Fortpflanzungstod bei Hermaphroditen, unabhängig davon, ob (bei letzteren) Es hat eine Fortpflanzung durch Selbstbefruchtung stattgefunden. Wenn die Paarung den Fortpflanzungstod bei Weibchen auslöst, könnte man erwarten, dass sie auch die Entlüftung des Eigelbs induziert: Entscheidend ist, dass der Fortpflanzungstod im Einklang mit der Semelparität mit irgendeiner Form von Fitnessvorteil einhergeht. Bei verpaarten Weibchen wurden jedoch nur sehr geringe Mengen an entlüftetem Eigelb festgestellt (ergänzende Abbildung 1a). Bei der Paarung von C. elegans verringerte sich die Menge an entlüftetem Eigelb, wie es bei allen hermaphroditischen Arten der Fall war, was wahrscheinlich auf eine erhöhte Aufnahme von Eigelb in Eizellen zurückzuführen ist, die anschließend befruchtet werden. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass der Fortpflanzungstod bei Weibchen nur für die Eizellenproduktion an die Eigelbproduktion gekoppelt ist, die Existenz eines solchen Vorteils ist jedoch noch nicht bewiesen; Daher bleibt unklar, ob eine paarungsbedingte Pathologie bei Weibchen mit einem Fortpflanzungsvorteil verbunden ist, dh ob bei begatteten Weibchen ein Fortpflanzungstod auftritt.

Nach diesem Modell erfordert die Entwicklung des reproduktiven Todes bei Hermaphroditen eine konstitutive Aktivierung von Prozessen, die normalerweise die Einleitung einer Paarung erfordern. Die Entwicklung des Hermaphroditismus bei C. elegans begann wahrscheinlich, als Weibchen die Fähigkeit entwickelten, Selbstspermien zu erzeugen und zu aktivieren32. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Entstehung von Selbstsperma ausreichte, damit der reproduktive Tod konstitutiv wurde. Um dies zu untersuchen, haben wir getestet, ob die Aufhebung der Selbstspermaproduktion bei Caenorhabditis-Hermaphroditen die Seneszenzpathologie unterdrücken und die Lebensdauer verlängern würde. Die verwendeten Interventionen waren Fog-2 (q71) und Fem-3 (e2006) in C. elegans33,34, She-1 (v35) und She-1 (v49) in C. briggsae35 sowie RNAi eines mutmaßlichen Fem-3-Orthologen (Csp11.Scaffold629.g10847, Ctr-fem-3) in C. Tropicalis.

Die Blockierung der Eigenspermienproduktion unterdrückte die Entwicklung einer seneszenten Pathologie nicht (Abb. 3d). Allerdings verlängerte es die Lebensdauer in mehreren Fällen – bei C. elegans mit Fog-2, aber nicht mit Fem-3, was in beiden Fällen mit früheren Erkenntnissen übereinstimmt4,19, und bei C. briggsae mit She-1 –, jedoch in keinem Fall Ausmaß der weiblichen Lebenserwartung von Geschwisterarten (Abb. 3e). Bei C. Tropicalis reduzierte Ctr-fem-3-RNAi die Lebensdauer stark, was möglicherweise auf pleiotrope Effekte zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der konstitutive reproduktive Tod keine einfache Folge der Entwicklung der Selbstbefruchtung ist. Sie lassen jedoch die Möglichkeit offen, dass das Auftreten von Selbstsperma zu einem mehrstufigen Evolutionsprozess beiträgt. Die Möglichkeit, dass der Fortpflanzungstod bei selbstbefruchtenden Hermaphroditen eine Folge der Fortpflanzung selbst ist, wurde durch die frühe Beobachtung ausgeschlossen, dass sterile Hermaphroditen (z. B. aufgrund von befruchtungsdefekten Spermien) nicht langlebig sind3,29. Während also die Fortpflanzung per se die Lebensspanne nicht verkürzt, kann das Vorhandensein von Selbstsperma dies in gewissem Maße tun.

Bei semelparen Arten, bei denen der Fortpflanzungstod mit der Fortpflanzungsreife ausgelöst wird, kann die Vorwegnahme der Fortpflanzung die Lebensdauer erheblich verlängern1,2. Beispielsweise kann die Entfernung von Blüten vor der Bestäubung die Lebensdauer von Sojabohnen von 119 auf 179 Tage verlängern36, und eine Gonadektomie von pazifischen Lachsen vor dem Laichen kann die maximale Lebensdauer von 4 Jahren auf bis zu 8 Jahre verlängern15. In ähnlicher Weise verlängert die Verhinderung der Keimbahnentwicklung bei Hermaphroditen von C. elegans die Lebensdauer erheblich5 und unterdrückt die Darmatrophie9.

Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Keimbahnablation die Lebensdauer von C. elegans verlängert, indem der reproduktive Tod unterdrückt wird. Angesichts des Fehlens eines mutmaßlichen reproduktiven Todes bei unverpaarten Caenorhabditis- und Pristionchus-Weibchen lässt dies darauf schließen, dass die Keimbahnablation die Lebenserwartung bei Hermaphroditen stärker verlängern wird als bei Weibchen, und das hat sich auch bestätigt. Die Keimbahnablation mittels Lasermikrochirurgie5 unterdrückte schwerwiegende Pathologien (Abb. 4a, b) und führte bei Hermaphroditen zu einer starken Verlängerung der Lebensdauer, bei Frauen jedoch nur zu einer geringfügigen Verlängerung (Abb. 4c). Die Ablation der gesamten C. elegans-Gonade unterdrückt die Darmatrophie nicht (ergänzende Abbildung 6c). Dies impliziert, dass Keimbahnablationseffekte auf die Seneszenzpathologie das Vorhandensein der somatischen Gonade erfordern, wie dies auch für Auswirkungen auf die Lebensdauer der Fall ist5. Dies deutet darauf hin, dass der reproduktive Tod durch Signale der somatischen Gonade unterdrückt wird; Zu den lebensverlängernden Wirkungen der somatischen Keimdrüse gehört insbesondere die Signalübertragung an den DAF-12-Steroidhormonrezeptor5,37.

Eine Keimbahnablation unterdrückt das Fortschreiten der Pathologie bei Hermaphroditen stark (vgl. Abb. 2d; n = 5–10 pro Zeitpunkt). Für vollständige Pathologiemessungen siehe ergänzende Abbildung 6a und für das Fortschreiten der Pathologie bei Mutanten mit Keimbahndefizit siehe ergänzende Abbildung 6b. b Repräsentative Nomarski-Mikroskopiebilder, die zur Bewertung von Pathologien aufgenommen wurden. c Die Ablation der Keimbahn verlängert die Lebensdauer von Hermaphroditen stark, nicht jedoch von weiblichen Nematodenarten. In ähnlicher Weise erhöht die Blockierung des reproduktiven Todes bei semelparen Arten die Lebenserwartung erheblich, während die Gonadektomie bei iteroparen Arten insgesamt nicht zunimmt. Für Caenorhabditis- und Pristionchus-Arten wird der Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Versuchen angezeigt (Sterne, Log-Rank-Test für abgetragene vs. Kontrolltiere und Cox-Proportional-Hazard-Test zum Vergleich der Wirkung bei Hermaphroditen vs. Weibchen). Die Werte für andere Arten stammen aus einer aktuellen Übersicht2; Für mehrere Studien derselben Art werden nur Referenzen mit sowohl männlichen als auch weiblichen Daten einbezogen, und für A. anguila (Aal) Daten aus der aktuellsten Quelle78. Daten zur Pathologie nach Ablation der gesamten Gonade finden Sie in der ergänzenden Abbildung 6c. Für einzelne Versuche, Einzelheiten zu Statistiken und Rohdaten zur Lebensdauer siehe ergänzende Abbildung 7, ergänzende Tabelle 4 bzw. Quelldatendatei. * p < 0,05, ** p < 0,01, **** p < 0,00001.

Wir haben auch veröffentlichte Berichte untersucht, in denen die Auswirkungen einer Gonadektomie auf die Lebensdauer oder, bei einigen semelparen Arten, die Verhinderung des reproduktiven Todes auf andere Weise untersucht wurden. Dies bestätigte, dass eine starke Verlängerung der Lebensdauer typisch für semelpare, aber nicht für iteropare Organismen ist (Abb. 3c). Die Lebenserwartung von Hermaphroditen und Weibchen bei keimbahnabgetragenen Tieren in jedem Geschwisterartenpaar war ähnlich (ergänzende Abbildung 7), was die Hypothese stützt, dass die kürzere Lebenserwartung von Hermaphroditen auf den Fortpflanzungstod zurückzuführen ist.

Die in dieser Studie vorgestellten Ergebnisse zeigen zusammen mit früheren Erkenntnissen, dass eine Reihe von Eigenschaften von C. elegans den Kriterien entsprechen, die zur Definition des Fortpflanzungstodes bei semelparen Arten verwendet werden, d. h. sie stützen die Hypothese, dass es zu einem Fortpflanzungstod kommt. C. elegans-Hermaphroditen weisen relativ früh im Erwachsenenalter erhebliche anatomische Veränderungen eindeutig pathologischer Natur (Degeneration, Tumore) in Organen auf, die mit der Fortpflanzung in Zusammenhang stehen bei unverpaarten Weibchen beobachtet. Hermaphroditen leben kürzer als Weibchen ihrer Schwesterarten, jedoch nicht nach der Entfernung der Keimbahn, was nur bei Hermaphroditen zu einer starken Verlängerung der Lebensdauer führt. Dies steht im Einklang mit der Hypothese, dass die Entfernung der Keimbahn, ähnlich wie die Gonadektomie beim pazifischen Lachs, die Lebensdauer verlängert, indem sie den reproduktiven Tod verhindert.

Dementsprechend ähneln C. elegans-Männchen Caenorhabditis-Weibchen darin, dass sie keine größeren degenerativen Pathologien wie Darmatrophie und Keimdrüsenzerfall aufweisen9,23 und die Keimbahnentfernung bei C. elegans-Wildtyp-Männchen hat kaum Auswirkungen auf die Lebensdauer39. Darüber hinaus führt die Verhinderung der Fortpflanzungsreife durch Gonadektomie oder andere Maßnahmen typischerweise zu einer starken Verlängerung der Lebensdauer bei semelparen Organismen, nicht jedoch bei iteroparen Organismen2,38 (Abb. 4c).

Ein charakteristisches Merkmal semelparer Organismen, die einen Fortpflanzungstod aufweisen, ist, dass ihre Lebensdauer nach der Fortpflanzung sehr kurz ist. Während selbstsüchtige Hermaphroditen relativ gesehen (d. h. im Verhältnis zu ihrer Gesamtlebensspanne) eine lange postreproduktive Lebensspanne haben, ist diese Zeitspanne in absoluten Zahlen sehr kurz (~2 Wochen, unter Standardkulturbedingungen). Darüber hinaus sind Hermaphroditen mit Spermienmangel nicht zwangsläufig postreproduktiv, da es zu einer Eigelbentleerung kommt14.

Die Paarung mit Männchen führt bei Weibchen zu pathologischen Veränderungen, die denen ähneln, die bei unbefruchteten Hermaphroditen beobachtet werden (Abb. 2c, d; 3b, c), was die Möglichkeit nahelegt, dass der Fortpflanzungstod auch bei begatteten Weibchen auftritt. Während es bei Hermaphroditen Hinweise darauf gibt, dass die Darmdegeneration mit der Produktion von entlüftetem Eigelb in einem Fitness-Kompromiss einhergeht9,14, fehlen derzeit Beweise für einen ähnlichen Kompromiss bei begatteten Weibchen; Die Paarung induziert keine Eigelbentlüftung (ergänzende Abbildung 1). Ein möglicher Kandidat für einen solchen Vorteil ist eine erhöhte Dotterproduktion zur Eizellenversorgung.

Dass die lebensverkürzenden Auswirkungen der Exposition gegenüber Männern sowohl durch die Samenflüssigkeit31 als auch durch männliche Pheromone40,41 gefördert werden, wurde als Hinweis auf einen sexuellen Konflikt interpretiert42. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die lebensverkürzenden Auswirkungen von Männern auf Frauen/Hermaphroditen ein Kostenfaktor sind, der mit einer für beide Seiten vorteilhaften Steigerung der Fitness aufgrund des reproduktiven Todes verbunden ist. Diese beiden Möglichkeiten schließen sich nicht gegenseitig aus; Insbesondere schützt das Vorhandensein von Selbstsperma vor den lebensverkürzenden Auswirkungen männlicher Exposition43,44, was mit sexuellen Konflikten vereinbar ist. Dieser Schutzmechanismus wird durch mehrere Signalkomponenten vermittelt, darunter den CEH-18-Transkriptionsfaktor, den VAB-1-Ephrin-Rezeptor43, insulinähnliche Peptide und den mTOR-TFEB-Signalweg44.

Das Auftreten eines reproduktiven Todes (d. h. Semelparität) bei C. elegans hätte tiefgreifende Auswirkungen sowohl auf das Verständnis der Biologie des Alterns als auch darauf, was man von C. elegans als Modell für das Altern im Allgemeinen lernen kann. Zuvor wurde vorgeschlagen, dass einige seneszente Pathologien das Ergebnis eines vitellogenen Quasiprogramms45,46 sind, d. h. einer vergeblichen Weiterführung eines Dotterproduktionsprogramms nach der Reproduktion7,9,13. Dies ist zwar immer noch möglich, aber wenn die spätere Eigelbproduktion einen Fitnessvorteil bringt, würden solche Seneszenzpathologien stattdessen Reproduktionskosten verursachen. Solche Vorteile könnten aus der Dotterfütterung durch die Larven entstehen, wenn diese entweder im Inneren der Mutter schlüpfen oder wenn externe Larven den entlüfteten Dotter verzehren (was auf Kosten der „Laktation“ hinweist)14. Fitnessfördernde Prozesse, mit denen die Bildung von Uterustumoren gekoppelt ist, sind jedoch (noch) nicht identifiziert; Somit scheinen Uterustumoren, wie die Eierstock-Teratome, denen sie ähneln24, das Ergebnis von Quasi-Programmen zu sein. Daher sind wahrscheinlich sowohl kostspielige Programme46 als auch Quasi-Programme bei der hermaphroditischen Seneszenz von C. elegans wirksam.

Wie in der Einleitung dargelegt, hat das Wort semelparös zwei sich überschneidende Bedeutungen: (i) nur einen einzigen Fortpflanzungszyklus haben und (ii) sich einmal fortpflanzen, gefolgt vom reproduktiven Tod. Zum ersten Sinn: Die Unterscheidung zwischen Semelparität und Iteroparität kann wohl schwierig auf Organismen mit sehr kurzer Lebensdauer anzuwenden sein, wie etwa Caenorhabditis-Arten47. Allerdings ist die sehr kurze Fortpflanzungsdauer von C. elegans in Kombination mit den hier vorgelegten Beweisen für den Fortpflanzungstod ein Beweis für Semelparität im zweiten und im weiteren Sinne im ersten Sinne des Wortes.

Das Aufregendste an der Entdeckung von Interventionen, die zu einer deutlichen Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans führen, war die implizierte Existenz von Mechanismen mit starken Auswirkungen auf das Altern insgesamt. In Kombination mit der Annahme, dass die Alterungsrate eine Funktion der somatischen Erhaltung ist48, deutete dies darauf hin, dass beim Menschen eine ähnliche Plastizität vorhanden sein könnte, die sich auf den gesamten Alterungsprozess auswirkt und ein mögliches Ziel für zukünftige Interventionen zur deutlichen Verlangsamung des Alterungsprozesses darstellt. Hier legen wir Beweise dafür vor, dass die Lebensdauer von C. elegans durch reproduktiven Tod begrenzt ist. Wir haben auch an anderer Stelle argumentiert, dass der reproduktive Tod die Entwicklung des seltenen Phänomens des programmierten adaptiven Todes, das die Lebensspanne weiter verkürzt, zulässt, und dass dies möglicherweise bei C. elegans aufgetreten ist49,50,51. Die Unterdrückung solcher programmatischer Ätiologien des Alterns bietet eine mögliche Erklärung für das ungewöhnlich große Ausmaß der bei C. elegans beobachteten Verlängerung der Lebensspanne. Dies erhöht die Möglichkeit, dass in iteroparen Organismen kein ähnlicher Kernmechanismus des Alterns als Ganzes existiert, der manipuliert werden kann, um eine dramatische Verlangsamung des Alterns herbeizuführen. Leider könnten unsere Ergebnisse in gewisser Hinsicht das Mysterium der lebenslangen Plastizität von C. elegans erklären.

Bedeutet das Eintreten des reproduktiven Todes, dass C. elegans an Mechanismen stirbt, die mit denen der meisten anderen Organismen nichts zu tun haben? Wir glauben nicht. In der Vergangenheit wurde scharf zwischen echter Alterung, die durch stochastische Schadensanhäufung verursacht wird, und programmierter Alterung, wie sie bei Pflanzen (z. B. Blattalterung) und semelparen Arten wie dem Pazifischen Lachs beobachtet wird, unterschieden1,2. Es wurde jedoch erkannt, dass evolutionär konservierte Regulatoren der phänotypischen Plastizität im Alter, wie z. B. Insulin/IGF-1 und das mechanistische Ziel von Rapamycin (mTOR), über programmatische Mechanismen wirken können, um die Seneszenzpathologie zu fördern45,52,53,54. Die Hemmung dieser Wege kann zu einer starken Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans, aber auch zu geringeren Auswirkungen bei höheren Tieren führen; Beispielsweise kann eine Mutation der Phosphatidylinositol-3-Kinase die mittlere Lebensdauer bei C. elegans um das ~10-fache verlängern, bei Drosophila und der Maus jedoch nur um das ~1,07-fache bzw. ~1,02-fache6,55,56.

Angesichts der evolutionären Erhaltung der Rolle dieser Signalwege beim Altern schlagen wir vor, dass sich Mechanismen des reproduktiven Todes durch eine Umnutzung programmatischer Mechanismen entwickeln, die das Altern in iteroparen Organismen in geringem Maße beeinflussen2,38. Es wurde argumentiert, dass semelpare und iteropare Lebensgeschichten keine isolierten Phänomene sind, sondern vielmehr ein Kontinuum darstellen57. Unterstützt wird dies durch den beobachteten Gradienten zwischen dem Vorhandensein und Fehlen eines mutmaßlichen reproduktiven Todes bei allen Nematodenarten und bei C. elegans bei Interventionen, die Pathologien des reproduktiven Todes unterdrücken und die Lebensdauer verlängern, einschließlich Keimbahnablation und reduziertem IIS (Abb. 5). Selbst wenn C. elegans tatsächlich einen reproduktiven Tod erleidet, bleibt es ein gutes Modell für das Verständnis der programmatischen Mechanismen des Alterns, die zur seneszenten Multimorbidität beitragen und bei metazoischen Organismen universell sind46.

Korrelation zwischen mit dem reproduktiven Tod verbundenen Pathologien und der Lebensdauer bei verschiedenen Arten und nach unterschiedlichen Behandlungen bei C. elegans, was das Vorhandensein eines Semelparitäts-Iteroparitäts-Kontinuums unterstützt. X-Achse, mittlerer Pathologie-Z-Score. Y-Achse, mittlere Lebensdauer (unverpaart, mit Antibiotika behandelt). Andere Datenquellen: RNAi-Pathologie und Lebensdauer13; Lebensdauer von Mutanten79. Für mutierte Pathologiemessungen siehe ergänzende Abbildung 8.

Zur Vorabbestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Die Experimente waren nicht randomisiert. Sofern nicht anders angegeben, waren die Forscher hinsichtlich der Zuordnung während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle statistischen Tests an Rohdaten mit GraphPad Prism 8.0 durchgeführt.

Die Pflege von C. elegans und anderen Arten erfolgte nach Standardprotokollen58. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Stämme und Arten bei 20 °C auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) mit Platten gezüchtet, die mit E. coli OP50 als Nahrungsquelle besät waren. Für C. elegans wurde ein kürzlich vom Caenorhabditis Genetics Center erhaltener N2-Zwitterstamm als Wildtyp (N2H) verwendet (Lit. 59). Die Genotypen der verwendeten C. elegans-Mutantenstämme sind in Wormbase (www.wormbase.org) beschrieben und umfassen CB3844 fem-3 (e2006), CB4037 glp-1 (e2141), GA14 fog-2 (q71) und GA114 daf-16 (mgDf50); daf-2(e1370), GA1928 daf-2(e1370), GR1307 daf-16(mgDf50) und SS104 glp-4(bn2). Sofern nicht anders angegeben, handelte es sich bei den Stämmen für andere Nematodenarten um VT847 C. briggsae, NK74SC C. inopinata, JU1325 C. nigoni, JU1373 C. Tropicalis, JU1873 C. wallacei, RS5522 P. exspectatus und RS2333 P. pacificus. Die weiblichen C. briggsae-Mutanten RE665 she-1(v35) und RE770 she-1(v49) wurden ebenfalls verwendet und mit C. briggsae (AF16) verglichen, von dem diese Mutanten abgeleitet sind35. C. inopinata wurden bei 25 °C bis zum L4-Stadium gehalten und dann auf 20 °C übertragen, da sie bei letzterer Temperatur eine sehr langsame Entwicklungsrate aufweisen21. Temperaturempfindliche Mutanten ( glp-1, glp-4, she-1) und begleitende Kontrollen wurden bei 15 °C bis zum L4-Stadium gehalten und dann auf 25 °C, die nicht zulässige Temperatur, umgestellt.

Die Identifizierung von C. Tropicalis-Orthologen von C. elegans Fog-2 und Fem-3 wurde mit Wormbase ParaSite60,61 durchgeführt. Nach der Protein- und DNA-Sequenzausrichtung62 wurde C. Tropicalis Csp11.Scaffold629.g10847 als C. elegans fem-3-Ortholog bezeichnet. In C. Tropicalis wurde kein Ortholog von C. elegans fog-2 gefunden, was mit Unterschieden in der Regulierung der Spermienfunktion bei diesen beiden Arten übereinstimmt63. Drei RNAi-Targeting-Regionen wurden entwickelt, um die Effizienz des Knockdowns zu verbessern. Um dsRNA für die Mikroinjektion zu synthetisieren, wurden drei PCR-Produkte für die In-vitro-Transkription mit spezifischen Primern mit T7-Promotorsequenzen (TAATACGACTCACTATAGGG) an den 5'-Enden erzeugt. Die PCR-Zyklusbedingungen waren 95 °C 30 Sek., 47 °C 30 Sek., 72 °C 60 Sek. für 30 Zyklen. PCR-Produkte wurden durch Gelextraktion mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) gereinigt. dsRNAs wurden in vitro mit einem MAXIscript T7 Transcription Kit (ThermoFisher) synthetisiert, gefolgt von einer RNA-Gelelektrophorese, um Produktgröße und -qualität zu analysieren. Als nächstes wurden die drei dsRNAs in einem Verhältnis von 1:1:1 mit einer Endkonzentration von 0,1 μg/μl gemischt und dann in beide Arme der Gonade eines 1 Tag alten erwachsenen C. Tropicalis injiziert64. Injizierte Nematoden wurden gewonnen und man ließ sie 6 Stunden lang bei 25 °C Eier legen, um entwicklungssynchronisierte Nachkommen zu erhalten. Diese wurden dann einzeln in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit mit OP50 ausgesätem NGM übertragen und bis zum Erwachsenenalter gezüchtet. Ungefähr 50 % erwiesen sich als steril und hatten ansonsten eine normale Größe und ein normales Aussehen und wurden für experimentelle Versuche verwendet. Als Negativkontrollen wurden Nachkommen von nicht injizierten C. Tropicalis-Hermaphroditen verwendet. Siehe auch ergänzende Abbildung 9 und ergänzende Tabellen 5–7.

Lebende Nematoden wurden auf 2 %-Agar-Pads gelegt und mit einem Tropfen 0,2 % Levamisol betäubt. Die Bilder wurden entweder mit einem Zeiss Axioskop 2 plus-Mikroskop mit einer Hamamatsu ORCA-ER-Digitalkamera C4742-95 und der Velocity 6.3-Software (Macintosh-Version) zur Bildaufnahme aufgenommen; oder ein ApoTome.2 Zeiss-Mikroskop mit einer Hamamatsu-Digitalkamera C13440 ORCA-Flash4.0 V3 und Zen-Software. Helligkeit und Kontrast wurden im gesamten Bild gleichmäßig angepasst und ggf. gleichermaßen auf die Bedienelemente angewendet.

Die Vorbereitung der Nematodenproben basierte auf dem Standardprotokoll65 (Protokoll 8). Kurz gesagt, die Tiere wurden zweimal in M9-Puffer gewaschen, in Fixierlösung (2,5 % Glutaraldehyd, 1 % Paraformaldehyd in 0,1 M Saccharose, 0,05 M Cacodylat) gegeben und, um die Penetration des Farbstoffs zu erhöhen, unterhalb des Rachens geschnitten, um die Köpfe mit einem 30 mm zu entfernen G Injektionsnadel. Anschließend wurden sie dreimal in 0,2 M Cacodylat gespült, in 0,5 % OsO4 und 0,5 % KFe(CN)6 in 0,1 M Cacodylat auf Eis fixiert und nacheinander in 0,1 M Cacodylat und 0,1 M Natriumacetat gewaschen. Anschließend wurden die Nematoden 60 Minuten lang in 1 % Uranylacetat in 0,1 M Natriumacetat (pH 5,2) gefärbt, dreimal in 0,1 M Natriumacetat gespült und dann über Nacht in Milli-Q-Wasser gespült. Die Proben wurden dann in 3 % Seaplaque-Agarose eingebettet, dehydriert und mit einer Reihe von Ethanol und Propylenharz infiltriert und dann 3 Tage lang bei 60 °C ausgehärtet.

Für die Lichtmikroskopie wurden serielle 1-μm-Schnitte angefertigt und aus einem Bereich hinter dem hinteren Uterus ultradünne Schnitte (70–80 nm) mit einem Diamantmesser auf einem Reichert-Ultramikrotom geschnitten. Vergleichsbilder mit geringer Vergrößerung, die Hälften von Nematoden-Geschwisterartenpaaren zeigen, wurden aus ungefähr derselben Region der Tiere aufgenommen, die den hinteren Darm enthält. Die Schnitte wurden auf mit Formvar beschichteten Schlitzgittern von 2 × 1 mm gesammelt, wodurch Bilder mit geringer Vergrößerung ohne Gitterstäbe aufgenommen und mit Bleicitrat angefärbt werden konnten, bevor sie in einem Joel 1010-Transmissionselektronenmikroskop betrachtet und abgebildet wurden. Die Bilder wurden mit einer Gatan Orius CCD-Kamera aufgenommen und mit der Gatan-Bildgebungssoftware erstellt. Helligkeit und Kontrast wurden im gesamten Bild gleichmäßig angepasst und ggf. gleichermaßen auf die Bedienelemente angewendet.

Die Tiere wurden ab dem Eistadium in einer Dichte von 25–30 Tieren pro Platte gehalten, um die mit der Populationsdichte verbundenen Auswirkungen auf das Altern zu minimieren, die bei C. elegans66 auftreten, und ohne den Zusatz von FUDR. Nematodenkohorten wurden alle 2–3 Tage hinsichtlich der Toten bewertet und alle Tiere während der Fortpflanzungsperiode täglich und danach alle 6–7 Tage übertragen. Würmer wurden als lebendig gewertet, wenn sie beweglich waren oder überhaupt auf sanfte Berührung mit einem Platin-Wurmstocher reagierten. Für Überlebenstests an UV-bestrahlten Bakterien wurden 80 μl E. coli OP50 zu jeder NGM-Platte gegeben und über Nacht bei 20 °C belassen. Anschließend wurden die Platten 30 Minuten lang in einem Stratalinker-UV-Ofen UV-Licht ausgesetzt. Nematoden wurden auf UV-behandelten Bakterien aus aseptischen Eiern gezüchtet. Rohe Mortalitätsdaten für alle Studien werden in Ziehm-Tabellen67 in der Quelldatendatei bereitgestellt, um eine genaue Prüfung der Daten (einschließlich zukünftiger Neuanalysen) zu ermöglichen. Überlebensdiagramme zeigen kombinierte Lebensspannendaten und Einzelversuche, wobei das L4-Entwicklungsstadium als Tag 0 angenommen wird. Tiere, die von der Platte verschwanden, während der Handhabung versehentlich getötet wurden, aufgrund von Austrocknung an der Wand der Petrischale starben, durch die Vulva platzten oder starben aufgrund des inneren Schlüpfens der Larven wurden als zensiert erfasst. Bei der statistischen Auswertung wurden zensierte Werte berücksichtigt. Tests für statistisch signifikante Unterschiede zwischen dem Überleben von Kohorten verwendeten den Log-Rank-Test und für signifikante Unterschiede im Ausmaß der Auswirkungen zweier Behandlungen eine Cox-Proportional-Hazard-Analyse, die in beiden Fällen mit der JMP-Software, Version 14.0 (SAS Institute, Inc.) durchgeführt wurde. ).

L4-Larven wurden einzeln auf 35-mm-NGM-Platten mit E. coli OP50-Rasen gehalten (n = 10 pro Versuch) und alle 24 Stunden übertragen, bis die Produktion unbefruchteter Eizellen aufhörte, wobei für alle Würmer mindestens 12 Tage gezählt wurden. Zum Einritzen wurde die offene Petrischale auf eine umgedrehte Platte mit einem Gitter aus parallelen Linien gestellt, sodass die Platte mit einer Reihe vertikaler Bewegungen effizient eingekerbt werden konnte. Wo Eizellklumpen zu sehen waren, wurden diese vorsichtig mit einem Wurmpicker abgetrennt, um die einzelnen Eizellen zu zählen. P. pacificus und P. exspectatus legten ebenfalls einige tote Eier, was mit früheren Beobachtungen (RJ Sommer, persönliche Mitteilung) übereinstimmt, die jedoch nicht berücksichtigt wurden.

Die Quantifizierung des entlüfteten Eigelbproteins wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt14. Kurz gesagt, 100–200 L4-Larven wurden auf 35-mm-Platten mit E. coli OP50-Rasen gehalten und täglich auf neue Platten übertragen. Nach dem Transfer wurde das entlüftete Eigelb mit 1 ml M9, das 0,001 % NP-40 enthielt, um Vitellogenin zu solubilisieren, wie beschrieben68, und 2 μg/ml BSA als externem Standard abgewaschen. Anschließend wurde es zentrifugiert, um die Fraktionen vor der Lyophilisierung abzutrennen. Nach der Lyophilisierung wurde das Eigelb in einer Lösung resuspendiert, die aus 30 μl 4 % SDS-Lösung pH 9, 10 μl DTT, 1 ml 1 M Tris HCL pH 8, 10 μl 0,5 M EDTA, 5 ml Milli-Q-Wasser und 12 mg Bromphenol bestand Blau.

Für die Quantifizierung des internen (nicht entlüfteten) Eigelbs wurde ein Protokoll verwendet, das dem zuvor beschriebenen ähnelt13. Kurz gesagt, 10 Tiere pro Zustand und Behandlung wurden auf NGM-Platten ohne Bakterien übertragen und 30–60 Sekunden lang kriechen gelassen, um Bakterien von der Nematodenoberfläche zu entfernen. Anschließend wurden sie in 25 µl M9 überführt und sofort bis zur Verwendung bei –80 °C eingefroren.

Die Proben wurden mit 25 μl 2 × Laemmli-Probenpuffer (Sigma-Aldrich) gemischt, bei 70 °C inkubiert und regelmäßig 15 Minuten lang gevortext, und dann 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und 15 Minuten lang bei 6.000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde für alle Proben eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt, wobei Criterion XT Precast Gels 4–12 % Bis-Tris (Invitrogen) und XT MOPS (Invitrogen) als Laufpuffer (Verhältnis 7:1) verwendet wurden mit Milli-Q-Wasser) bei 90 V. Die Gele wurden wie beschrieben mit kolloidalem Coomassie-Blau gefärbt69, wobei 5 % Aluminiumsulfat-(14-18)-hydrat und 2 % Orthophosphorsäure (85 %) verwendet wurden, um kolloidale Partikel zu erzeugen. Die Gele wurden mit ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare) analysiert. Die Identifizierung der Proteinbanden basierte auf veröffentlichten Daten70. Innerhalb der Spuren wurden entlüftete YPs auf die BSA normalisiert, die während der Probenentnahme als externer Standard hinzugefügt wurde. Für Proben interner YPs wurden die YP-Banden als Standard auf Myosin normalisiert, um den Proteinverlust während der Gelbeladung zu berücksichtigen und um beim Vergleich verschiedener Arten eine Normalisierung auf die Nematodengröße zu ermöglichen.

Nomarski-Mikroskopiebilder von alternden Pathologien in Kohorten von Würmern (n = 5–10 pro Zeitpunkt, pro Zustand und pro Versuch) wurden an den Tagen 1, 4, 7, 11 und 14 aufgenommen und die Bilder entweder quantitativ (Darm, Dotterbecken) oder analysiert halbquantitativ und blind (Rachenschädigung, Gonadenatrophie und -fragmentierung, Uterustumoren) durch mehrere geschulte Beobachter wie beschrieben8,9,71. Kurz gesagt, die Darmatrophie wurde quantifiziert, indem die Darmbreite an einem Punkt zwischen der hinteren Gonade und dem Anus gemessen, die Breite des Darmlumens abgezogen und durch die Körperbreite dividiert wurde, um eine auf die Körpergröße normierte Schätzung der Darmquerschnittsbreite zu erhalten . Die Ansammlung von Eigelbansammlungen wurde gemessen, indem die Fläche der Eigelbansammlungen durch die Körperfläche geteilt wurde, die im Sichtfeld bei 630-facher Vergrößerung sichtbar war. Für die Verschlechterung des Rachenraums, die Atrophie und Fragmentierung der Gonaden sowie Uterustumoren wurden den Bildern Werte von 1–5 zugewiesen, wobei 1 = jugendliches, gesundes Aussehen; 2 = subtile Anzeichen einer Verschlechterung; 3 = deutlich erkennbare, leichte Pathologie; 4 = gut entwickelte Pathologie; und 5 = Gewebe so verschlechtert, dass es kaum noch erkennbar ist (z. B. Gonaden vollständig aufgelöst) oder ein maximales Ausmaß erreicht (z. B. großer Tumor, der die gesamte Körperbreite ausfüllt).

Die Bewertung wurde wie folgt an die verschiedenen Nematodenarten angepasst. Bei der Bewertung der Rachenseneszenz bei Pristionchus-Arten wurde das normale Fehlen eines Mahlwerks berücksichtigt72. Zur Beurteilung der Keimdrüsenalterung zählte zu den Kriterien für eine gesunde Keimdrüse, ob die beiden Arme der Keimdrüse einander berühren (was bei jungen Erwachsenen der Fall ist). Tiere, bei denen sich die Gonadenarme nicht berühren oder die eine Verengung an den Gonadenarmen aufweisen, erhielten eine Bewertung von 2, beide Merkmale erhielten eine Bewertung von 3 und zusätzlich eine Fragmentierung der Gonadenarme eine Bewertung von 4. Für die Bewertung von Uterustumoren bei jungen, unverpaarten Weibchen Eine leere Gebärmutter ohne Eizellen wurde mit 1 bewertet.

Um Daten für die Modellierung vorzubereiten, wurden die Daten aus folgenden Gründen vorverarbeitet. Das höchste Pathologieniveau für C. elegans und die meisten verpaarten Tiere (das die maximale Pathologieprogressionsrate zeigt) wird meist am 14. Tag erreicht, danach erreicht das Pathologieniveau ein Plateau. Somit verdecken Pathologiedaten nach Tag 14 die Berechnung von Gradienten, die die anfängliche Geschwindigkeit des Pathologiefortschreitens darstellen. Die Darmwerte für jede Artenkombination und Behandlung wurden auf den jeweiligen mittleren Darmwert am ersten Tag normalisiert. Daher stellen die normalisierten Darmpathologiewerte die prozentuale Änderung des Darmvolumens dar und erklären Unterschiede im Verhältnis der Darmbreite zum Gesamtkörper Breite zwischen den Arten. Für die Dotterpool-Scores wurde keine Normalisierung verwendet, da der Prozentsatz der Körperhöhle, die Dotterpools enthielt, gemessen wurde. Eigelb-Pools wurden mit einem Wert von +1 analysiert, um sicherzustellen, dass alle Daten positiv waren (eine Voraussetzung für die Gamma-Regression). Auf die Daten wurden verallgemeinerte lineare Modelle (GLMs) angewendet, um die Auswirkung von Spezies, Behandlung und Versuch auf das Fortschreiten der Pathologie zu testen. Interaktionsterme zwischen diesen Variablen wurden ebenfalls einbezogen. Je nach Art der aufgezeichneten Daten wurden systematisch unterschiedliche Modellfamilien und Verknüpfungsfunktionen auf jeden Pathologiedatensatz angewendet. Für positive, kontinuierliche Variablen (Darm- und Dotterpools) wurden Pathologie-Scores als Gauß- und Gamma-verteilte Variablen modelliert. Für ordinale Variablen (Tumor, Gonade und Pharynx) wurden kumulative Verknüpfungsmodelle unter Verwendung des ordinalen Pakets in R (Lit. 73) auf die Daten angewendet.

Die folgenden Modelle wurden für jede Pathologie basierend auf der Minimierung des Akaine-Informationskriteriums (AIC) ausgewählt, was bedeutet, dass diese Modelle die größte Varianz im Pathologieverlauf mit der geringsten Anzahl von Termen erklärten: (i) Darm: Gaußverteilte Antwortvariable mit umgekehrter Verknüpfung Funktion; (ii) Dotterpools: Gamma-verteilte Antwortvariable mit Identitätsverknüpfungsfunktion; und (iii) Tumor, Gonade und Rachen: ordinal verteilte Antwortvariable mit Log-Gamma-Link-Funktion. Die überwiegende Mehrheit der Studienbedingungen war nicht für alle Pathologien statistisch signifikant, was darauf hindeutet, dass die Unterschiede im Pathologieverlauf reproduzierbar und robust waren. Daher wurde der Versuch nicht weiter als Variable berücksichtigt. Um zu vergleichen, ob Unterschiede in der Pathologieprogression zwischen Artenkombinationen und Behandlungen statistisch signifikant waren, wurden t-Tests explizit auf Vergleiche von Interesse angewendet, wobei das Multcomp-Paket in R verwendet wurde (Lit. 74).

Für alle angezeigten Beispielbilder wurden die Experimente mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt und überprüft, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen.

Um Unterschiede im Pathologieverlauf zwischen verschiedenen Arten und Behandlungen zu vergleichen, wurden die Gradienten jedes Modells in Z-Scores umgewandelt (die die Beziehung eines Werts zum Mittelwert einer Gruppe von Werten beschreiben), die für den Vergleich von Pathologien untereinander erforderlich sind. Die Pathologie-Z-Scores werden als Heatmaps angezeigt und verglichen, wobei paarweise euklidische Unterschiede verwendet werden, um Pathologien und Arten/Behandlungen entsprechend der Profilähnlichkeit zu gruppieren. Um den Einfluss pathologischer Z-Scores auf die Lebensdauer zu modellieren, wurde eine lineare Regression durchgeführt, wobei der pathologische Z-Score als unabhängige Variable und der Kehrwert der mittleren Lebensspanne als abhängige Variable verwendet wurden. Um den kombinierten Einfluss aller Pathologien auf die Lebensdauer zu bewerten, wurde der Median der Pathologie-Z-Scores als unabhängige Variable verwendet. Die Z-Scores für alle Pathologien erwiesen sich als statistisch signifikant, und der mittlere Pathologie-Z-Score schnitt besser ab als die einzelnen Pathologien.

Lebende L1-Larven wurden auf einem Objektträger auf einem 5 %igen Agar-Pad mit Levamisol als Anästhetikum montiert. Die Konzentration von Levamisol und M9-Puffer/Milli-Q-Wasser-Verhältnis wurde für jedes Geschwisterartenpaar optimiert: 0,2 mM Levamisol in M9 für C. elegans, C. inopinata, C. Tropicalis und C. wallacei; 0,2 mM Levamisol in einem 1:1-Verhältnis von M9 zu Milli-Q-Wasser für C. briggsae und C. nigoni; und 0,1 mM Levamisol in M9 für P. pacificus und P. exspectatus. Die Ablationen wurden mit einem Zeiss Axioplan 2 durchgeführt, der mit einer Andor MicroPoint-Lasereinheit (CE N2 Laser mit Ctlr/PSU/IntLk) bei 440 nm und einem Dye Cell 435 nm-Filter ausgestattet war. Keimbahnvorläuferzellen (Z2 und Z3) wurden anhand ihrer Morphologie und Position mit Nomarski-Optik identifiziert und in frisch geschlüpften L1-Tieren unter Verwendung eines Standardprotokolls abgetragen75.

Nach der Ablation wurden die Larven für alle Artenpaare mit Ausnahme von C. briggsae und C. nigoni, die in einem Verhältnis von M9 zu Milli-Q von 1:1 gewonnen wurden, durch Abwaschen mit M9-Puffer (30 μl) auf frische Platten übertragen Wasser (insgesamt 30 μl). Anschließend ließ man alle abgetragenen Tiere sich bis zum ersten Tag des Erwachsenenalters erholen und untersuchte sie unter einem Nikon SMZ645-Mikroskop sowohl auf fehlende Eiablage, was darauf hinweist, dass die Ablation erfolgreich war, als auch auf das Vorhandensein einer Vulva, was darauf hindeutet, dass Z1 und Z4 Zellen waren intakt. Bei unverpaarten Weibchen, die keine Eier legen, wurden 15–20 zufällig ausgewählte Würmer pro Bedingung und Versuch mittels Nomarski-Mikroskopie (100-fache Vergrößerung mit einem 10-fachen Luftobjektiv, ohne Anästhesie) auf einer NGM-Platte auf das Vorhandensein einer voll entwickelten Gonade überprüft , und es wurde festgestellt, dass keiner einen hatte. Scheinbehandelte Tiere wurden den gleichen Manipulationen unterzogen wie abgetragene Tiere, abgesehen davon, dass sie mit dem Laser-Mikrostrahl beschossen wurden. Die Ablation der somatischen Gonade (durch Entfernung der Z1-4-Gonadenvorläuferzellen) wurde auf ähnliche Weise durchgeführt; Die resultierenden erwachsenen Würmer wurden überprüft, um das Fehlen einer Vulva zu bestätigen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Daten sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken L. Cao, B. Evans, D. Mills, S. Mirpuri, L. Montemayor, E. Morisot, C. Nguyen Hong, S. Theivendran, Y. Wang und X. Wei für technische Unterstützung und kleinere Beiträge , M. Turmaine für Hilfe bei der Elektronenmikroskopie, A. Barrios und RJ Poole für den Zugang zu Laserablationsanlagen, RE Ellis (Rowan University) für die Bereitstellung von C. briggsae she-1-Mutanten, N. Kanzaki und T. Kikuchi (FFPRI Tsukuba) für die Bereitstellung von C. inopinata, RJ Sommer (MPI Entwicklungsbiologie, Tübingen) für die Bereitstellung von Pristionchus-Arten. Wir danken außerdem AD Cutter (University of Toronto), M.-Q. Dong und C. Zhai (NIBS Beijing), D. Hall (Albert Einstein College of Medicine), RJ Sommer (Tübingen), V. Rottiers (UC Berkeley) und ER Galimov, T. Niccoli, Y. de la Guardia und andere Wissenschaftler beim Institute of Healthy Aging für Ratschläge und nützliche Diskussionen und/oder Kommentare zum Manuskript. Einige Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Diese Arbeit wurde durch einen Wellcome Trust Investigator Award (215574/Z/19/Z) an DG und einen Boehringer Ingelheim Funds Ph.D. unterstützt. Stipendium für ST Dieses Papier ist dem Gedenken an unseren lieben Co-Autor StJohn Townsend gewidmet, der kürzlich verstorben ist.

Verstorben: StJohn Townsend.

Institut für gesundes Altern und Forschungsabteilung für Genetik, Evolution und Umwelt, University College London, London, WC1E 6BT, Großbritannien

Carina C. Kern, Shivangi Srivastava, Marina Ezcurra, Kuei Ching Hsiung, Nancy Hui, StJohn Townsend, Dominik Maczik, Bruce Zhang, Victoria Tse, Viktoras Konstantellos, Jürg Bähler & David Gems

School of Biosciences, Stacey Building, University of Kent, Canterbury, Kent, CT2 7NJ, Großbritannien

Marina Ezcurra

Labor für Molekularbiologie des Stoffwechsels, Francis Crick Institute, London, NW1 1AT, Großbritannien

St. John Townsend

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DG überwachte das Projekt. DG und CCK konzipierten das Projekt, entwarfen die Experimente und Datenanalysen und verfassten das Manuskript. CCK, ME, NH, SS, VT und BZ führten Experimente durch. ME, NH, DM und VT führten die Erfassung und Analyse der Pathologiedaten durch. KCH führte Studien zu RNAi durch Injektion durch. NH half bei der Sammlung und Messung interner und entlüfteter Proteine. VK führte eine Gelelektrophorese durch und analysierte Proteingele. SS führte Lebensspannen durch und bewertete sie. SS und NH führten Laserablationen durch. ST und JB führten und interpretierten eine quantitative Analyse der Pathologie und einen Vergleich mit der Lebensdauer.

Korrespondenz mit David Gems.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kern, CC, Srivastava, S., Ezcurra, M. et al. Das Altern von C. elegans wird durch ein selbstzerstörerisches Fortpflanzungsprogramm beschleunigt. Nat Commun 14, 4381 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40088-1

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Eingegangen: 15. Januar 2021

Angenommen: 12. Juli 2023

Veröffentlicht: 20. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40088-1

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